磷酸化蛋白质组学技术

技术原理

在酸性条件下，二氧化钛(TiO₂)带正电荷，与肽段样品中具有磷酸化修饰肽片段上带负电荷的磷酸基团特异性结合。清洗缓冲液去除非磷酸化肽段后，用碱性洗脱液将结合于TiO₂上的磷酸化肽洗脱下来从而达到特异性富集磷酸化肽段的目的。之后，利用液相色谱-串联质谱对肽段的磷酸化位点进行鉴定。

应用领域 -

某一生理或病理条件下，器官、组织、细胞内蛋白质组磷酸化修饰谱的鉴定和定量分析

技术优点

二氧化钛富集方法能够特异性富集样品内95%的磷酸化蛋白
检测速度快，一个样品约5小时内完成
哺乳动物组织一个样品可鉴定约4000个蛋白，覆盖约10000个磷酸化肽

样品要求

蛋白质提取物 ≥2 mg
细胞 ≥10^7 个
组织 ≥100 mg （动物组织）
≥100 mg （植物组织）
体液 ≥20 μL （血清、血浆）
≥25 mL（尿液）
≥30 μL（唾液、脑脊液等体液）

可选仪器

Obitrap Fusion Lumos
Obitrap Fusion
Q Exactive HF
Q Exactive Plus
Q Exactive

技术流程

样本提取蛋白质，蛋白质经过还原，封闭后蛋白酶酶切（通常为trypsin）。脱盐后用二氧化钛富集磷酸化肽。洗脱后，肽段混合物液相分离后，进行MS/MS质谱检测。然后对质谱仪产出的数据进行蛋白质组鉴定及生物信息学分析。

数据分析内容

质谱数据质量评估
数据库鉴定数据统计
磷酸化肽的鉴定及定量结果
目标蛋白的磷酸化谱图确认
多样本间分类统计、聚类分析(适用于样本数大于3)
GO (Gene Ontology) 富集分析
KEGG Pathway通路富集分析
蛋白质相互作用（PPI）网络分析

参考文献

Thingholm, T. E., Jørgensen, T. J., Jensen, O. N., & Larsen, M. R. (2006). Highly selective enrichment of phosphorylated peptides using titanium dioxide. Nature protocols, 1(4), 1929-1935.